Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kurt Kızıldoğan A. (Yürütücü), Okay S., Tunca Gedik S.
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2021 - 2024
Proje kapsamında, ilaç hammaddesi olarak birçok değerli sekonder metabolitin verimli bir üreticisi Streptomyces clavuligerus’ta antibakteriyel ve sitotoksik özellikteki MM19290-tunikamisin türevi nükleozit antibiyotiğinin moleküler düzenlenmesi üzerine, tunRS iki bileşenli sistemin düzenleyici etkisinin belirlenmesi amaçlanmaktadır. Tunikamisin, LipitI oluşumunu hedef alarak b-laktam antibiyotiklerinden farklı bir basamakta hücre duvarı biyosentezini etkilediğinden b-laktama dirençli patojenlere karşı tedavide kullanılabilir. Yapısal çeşitliliği sayesinde ise ilaç tasarımı çalışmalarında yapısal bir iskele olarak önemlidir. S. clavuligerus’ta biyosentezi ve regülasyonu en çok çalışılan klavulanik asit (CA) ve sefamisin C (CephC)’le ilgili çeşitli bilimsel ve endüstriyel çalışmalar bulunmaktayken, tunikamisinin biyosentezinin moleküler düzenlenmesiyle ilgili çalışmalar oldukça sınırlıdır. Tunikamisin gen kümesinin yolağa konumlanmış bir regülatör (CSR) geninin olmaması bu antibiyotiğin nasıl düzenlendiği sorusunu karmaşıklaştırmaktadır. CSR’ye sahip olmayan moenomisin gibi antibiyotiklerin moleküler düzenlenmesi global regülatörler tarafından gerçekleştirilmektedir. Grubumuz tarafından BldG ve AdpA pleiotropik regülatörlerin tunikamisin biyosentezi üzerindeki etkisi çalışılmıştır. 2019’da CA ve CephC biyosentezinin regülasyonunda iki bileşenli sistem genlerinin düzenleyici rolü bildirilmiştir. Ancak, henüz TCS’nin tunikamisin biyosentezine etkisiyle ilgili bir çalışma literatürde bulunmamaktadır. Yaptığımız biyoinformatik analizler S.clavuligerus’ta tunikamisin gen kümesine çok yakın konumlanmış, SCLAV_4289 ve SCLAV_4290 genlerinden oluşan bir TCS’nin varlığını göstermiştir. Proje önerisi, ilk defa S. clavuligerus’ta tunikamisin biyosentez kümesine yakın konumdaki TunRS olarak adlandırdığımız TCS’nin (i) tunikamisin gen kümesinin ifadesinde ve tunikamisin biyosentezinde nasıl bir düzenlenmeyle ilgili olabileceğinin araştırılacağı ve (ii) TCS’nin S. clavuligerus’ta antibiyotik biyosentezi üzerindeki global etkisinin belirleneceği RNA-seq ve proteom-temelli ilk çalışma olması bakımından özgün değer taşımaktadır.
Yöntem: S.clavuligerus’ta tunRS (SCLAV_4289-90) genleri I-Sce-I meganükleaz stratejisiyle genomdan silinerek S. clavuligerus DtunRS mutantı oluşturulacaktır. Komplementasyon; tunRS genlerinin kendi promotoru altında pSET152 vektörüne klonlanıp DtunRS mutantının kromozomuna entegrasyonuyla sağlanacaktır. Southern blotla genlerin delesyonu doğrulanacaktır. tunRS genlerinin aşırı ifadesi için gliserolle uyarılabilen glpF promotoru altında pSPG vektörüne klonlanıp S. clavuligerus hücrelerine replikatif formda aktarılacaktır (S. clavuligerus pSPGtunRS). Ayrıca, S. clavuligerus pSPG vektör kontrolü oluşturulacaktır. Kontrolle birlikte suşlar farklı besiyerlerinde (TYD,TSBY,MYM) büyütülerek antibiyotik üretimleri karşılaştırılacaktır; tunikamisin ölçümü bioassay ve LC-MS/MS yöntemleriyle, CA ve CephC ölçümleri ise sadece biyoassay ile belirlenecektir. Ardından, S.clavuligerus DtunRS, pSPGtunRS ve pSPG suşlarının iki farklı saatte gen ifade farklılıkları ve protein üretim değişimleri transkriptom ve proteom seviyesinde belirlenecektir. İlk defa bu proje kapsamında, RNA dizileme ve nanoLC-MS/MS yöntemleri kullanılarak S.clavuligerus’ta tunRS mutant ve tunRS overekspres suşlarında gerek tunikamisin biyosentez genlerinin/proteinlerin gerekse de farklı yolaklarda bulunan genlerin/proteinlerin ifadelerindeki değişimler tespit edilerek bu verilerin entegrasyonuyla bütüncül bir yaklaşımla TCS’nin organizma üzerindeki global kontrol etkisi aydınlatılmaya çalışılacaktır. İfadelerinde farklılıklar görülen genlerden 10 tane seçilerek RT-qPCR ile RNA-seq verileri teyid edilecektir. RT-qPCR çalışmalarıyla tunikamisin genlerinin aynı koşullardaki gen ifade farklılıkları belirlenecek ve sonuçlar RNA-seq verileriyle karşılaştırılacaktır. Son aşamada, TunR protein affinite-kromatografisiyle saflaştırılıp Western Blot analiziyle doğrulandıktan sonra tunikamisin gen kümesindeki olası 3 promotorla bağlanma durumu EMSA’yla ortaya çıkarılacaktır.