Streptomyces clavuligerus'ta AdpA pleiotropik regülatörünün antibiyotik biyosentezi üzerine etkisinin belirlenmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2024
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ÇİĞDEM OTUR
Danışman: Aslıhan Kurt Kızıldoğan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) tunikamisin, sefamisin C (CephC) ve klavulanik asit (CA) gibi çok sayıda önemli sekonder metabolitin üreticisidir. Çalışmamız kapsamında literatürde ilk defa, S. clavuligerus'ta AdpA pleiotropik regülatörünün, antibiyotik biyosentezi ve üretimi üzerindeki etkisi RNA-seq analiziyle araştırılmıştır. SceI meganükleaz yöntemiyle adpA geni silinen mutant suş (S. clavuligerus ΔadpA), yabanıl suş (S. clavuligerus NRRL 3585), çok kopyalı adpA genine sahip rekombinant suş (S. clavuligerus pSPGadpA) ve bu suşun vektör kontrolü (S. clavuligerus pSPG)'ne ait TYD kültürleriyle (T48) yapılan RNA-seq analizinde gen ifadelerindeki farklılıkların global düzenleme mekanizmaları, metabolizma yolakları, sekonder metabolit ve antibiyotik biyosentez yolakları, membran taşınım ve sinyal iletim kategorilerinde yoğunlaştığı belirlenmiştir. Tunikamisin biyosentetik gen kümesinde tunABCDEH ve tunF, tunG ve tunL genlerinin ifadeleri mutantta yabanıl suşa kıyasla daha yüksekken S. clavuligerus pSPGadpA'da genel olarak gen ifadeleri kontrollere kıyasla azalmıştır. Bu veriler qRT-PCR ile doğrulanmıştır. Biyoassay ve LC-MS/MS analizleriyle S. clavuligerus ΔadpA'da yabanıl suşa kıyasla daha yüksek tunikamisin üretimi gerçekleştiği S. clavuligerus pSPGAdpA'da ise tunikamisin titresinin azaldığı belirlenmiştir. CA biyosentetik gen kümesinde, S. clavuligerus ∆adpA'da kontrole kıyasla argR, oat2, oppA1, orf14, orf16, gcaS, pbp2, orf20 ve orf21'nin ifadeleri azalırken ceaS2, pah2 ve pbpA'nın ifadeleri artmıştır. Ayrıca, S. clavuligerus ∆adpA'da CA üretimi kontrole kıyasla daha azdır. CephC gen kümesinde ise mutantta yabanıl suşa kıyasla pbpA, cmcT, pcd, cefE, cefD, cefF, cmcI, cmcJ, ccaR ve cmcH genlerinin ifadeleri artarken orf10, lat, pcbAB, pcbC ve pbpR'nin ifadeleri azalmıştır. Spesifik CephC üretimi S. clavuligerus ∆adpA'da özellikle T96 olmak üzere tüm saatlerde en yüksek CephC titresindedir. rAdpA'nın tunA geninin yukarı akış dizisine bağlandığı EMSA ile tespit edilmiştir. Ayrıca, RT-PCR çalışmalarıyla S. clavuligerus'da tunikamisin gen kümesinin çoğunlukla polisistronik transkriptler halinde transkribe oldukları gösterilmiştir. Çalışmamız S. clavuligerus'ta AdpA'nın antibiyotik biyosentezi ve global regülasyondaki rolünü detaylı bir şekilde sunmaktadır. Ayrıca, tunikamisin gen kümesinin transkripsiyonel organizasyonu ve de AdpA'nın bu gen kümesine doğrudan bağlanarak tunikamisin biyosentezi üzerindeki negatif regülasyon rolü ilk kez ortaya koyulmuştur.