PROKALSİTONİNE KARŞI SELEX YÖNTEMİYLE APTAMER GELİŞTİRİLMESİ
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Moleküler Tıp Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2024
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ÖMER EMECEN
Danışman: Sezgin Güneş
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Aptamerler, tıpkı antikorlar gibi moleküllere spesifik olarak yüksek afinite ile bağlanabilen kısa (20-100 nt) tek zincirli DNA/RNA yapılarıdır. Aptamerler hedef moleküllere bağlanması baz eşleşmesiyle değil üç boyutlu yapıları ile gerçekleşmektedir. Aptamerlerin seçilimi Ligandların Üstel zenginleştirme ile Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemiyle gerçekleştirilmektedir. Klinik laboratuvarlarda sepsis tanısı ve izleminde kullanılan prokalsitoninin ölçümü immünölçüm yöntemleri ile spesifik antikor çiftleri kullanılarak sandiviç (iki bölgeli) yöntem temelinde yapılmaktadır. Prokalsitonin ölçüm yöntemlerinin, prokalsitonine spesifik aptamerler kullanılarak geliştirilmesi de mümkündür. Tez çalışmamız ile prokalsitonin proteininin birden fazla epitop bölgesine spesifik olarak bağlanabilen birden fazla aptamer molekülünün SELEX yöntemiyle seçilimini amaçladık. SELEX yönteminin her bir turunda prokalsitonin oligonükleotit havuzu ile inkübe edildikten sonra bağlanan kısımın ayrıştırıldı, ayrılan kısım polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltıldı. On iki SELEX turu sonunda tıpkı başlangıç oligonükleotit havuzu gibi 3 boyutlu yapısına katlananarak hedef proteine bağlanabilen diziler elde edildi. Elde ettiğimiz ssDNA havuzunun prokalsitonine bağlanabilme afinitesinin artışını inkübasyon sonrası geri kazanılan ssDNA miktarının inkübasyona katılan ssDNA miktarına oranını izleyerek takip ettik. SELEX turları ilerledikçe geri kazanılan ssDNA oranında artış gösterdiğini gözlemledik. İnkübasyon sonrası geri kazanılan ssDNA miktarının inkübasyona katılan ssDNA miktarına oranları SELEX 1-12. turları için sırasıyla (%) 1,67, 23,28, 57,8, 15,53, 17,48, 52,05, 28,75, 64,53, 26,94,113, 22,96, 23,94 idi. Aynı epitop bölgelerine daha güçlü afiniteye sahip dizilerin bağlanma olasılığını artırmak için SELEX süreci boyunca ssDNA/prokalsitonin (mol/mol) oranı artırılarak seçilim baskısı artırıldı. ssDNA/prokalsitonin oranının artışına rağmen geri kazanılan ssDNA miktarlarında artışın gözlenmesi oligonükleotit havuzunun afinitesinin arttığını işaret etmektedir. Prokalsitonin alt birimlerine bağlanabilen bu ssDNA havuzlarının dizileme aşaması ile belirlenecek aptamer adaylarının prokalsitonin ve onun alt birimleri ile bağlanma deneyleri sonucunda aptamerler ortaya çıkacaktır. Antikorlara alternatif olarak kullanılabilme potansiyeli, üretiminin nispeten ucuz ve sürekliliğinin sağlanmasının kolaylığı nedeniyle bu çalışmadan elde edilen sonuçlar ile geliştirilecek aptamerler, prokalsitonin proteininin iki bölgeli hassas ölçüm yöntemi geliştirilmesinde kullanılarak yeni tanı kitlerinin tasarımlarına yol gösterici olacaktır.