Domateste doku kültürü, genetik transformasyon ve CRISPR/CAS9 sistemi ile genom işleme optimizasyonu
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ZAFER SEÇGİN
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Kubilay YILDIRIM
Danışman: Musa Kavas
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Solanaceae familyası içerisinde yer alan domates (Solanum lycopersicum), dünya çapında ikinci en önemli bahçe bitkisidir. Sağlık, ekonomik ve besleyici öneminin yanı sıra domates, etli meyve gelişimi çalışmaları ve genom manüpülasyon çalışmalarında model bitki olarak kullanılır. Genom düzenleme sistemleri kullanılarak elde edilen bitkilerin, tarla koşullarına doğrudan uygulanabilmesi için ticari domates çeşitlerinde de optimize edilmelidir. Rejenerasyon sistemi ve Agrobacterium kullanılarak yapılan gen aktarımı bitkilerde genom düzenlemenin temelini oluşturmaktadır. CRISPR/Cas9 sistemi, domates çeşitlerinde genom düzenleme amacıyla çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genom düzenleme çalışmalarında farklı fenotipik markör genleri kullanılarak yapılan genom düzenleme çalışmalarının etkinliği tespit edilmeye çalışılmaktadır. Bu genlerden biri olan phytoen desaturaz (PDS) geni bitkilerde albino fenotipler oluşturmaktadır Akonitaz hidrataz (ACO) geni ise TCA (Tricarboxylic Acid) döngüsü içerisinde yer alan, sitratı geri dönüşümlü olarak izositrata parçalamakta ve Acly-Coa üretimi ile ilişkili olduğundan polen oluşumu ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmanın amaçları, Crocker domates çeşitinde doku kültürü parametrelerini optimize ederek, etkili bir Agrobacterium gen aktarım protokolü oluşturmak ve CRISPR/cas9 genom düzenleme sistemi ile PDS geni hedeflemesine yönelik optimizasyon çalışmalarını gerçekleştirmektir. Çalışmanın diğer bir amacı ise CRISPR/cas9 genom düzenleme sistemi ile SlACO4 geninin düzenlemesini yapmak ve bu düzenlemenin polen oluşumu üzerine olan etkilerini belirlemektir. Crocker ticari domates çeşitinde doku kültürü optimize çalışmalarında kotiledon ve yaprak eksplantları farklı konsantrasyonlardaki benzyl adenin (BA) (0, 0.5, 1, 2, 3 ve 4 mg//L) ve indole 3-asetik asit (IAA) (0, 0.1, 0.5 ve1 mg/L) içeren MS besi ortamında test edilmişlerdir. Çalışmada Agrobacterium aracılı gen aktarımının etkinliği eksplant kaynağı, bakteri suşu ve konsantrasyonu ile inokülasyon süresi, ko-kültüvasyon süresi, ön-kültürleme süresi, antibiyotiklerin etkisi ve higromisin konsatrasyonu gibi farklı parametreler kullanılarak test edilmiştir. PDS ve SlACO4 genlerini CRISPR/Cas9 sistemi ile hedeflemek için ikişer adet klavuz RNA (gRNA) tasarlanmış ve Agrobacterium aracılı gen aktarımı yapılarak genom düzenlenmiş domates bitkileri başarılı bir şekilde elde edilmiştir. Çalışma sonuçları Crocker domates çeşitinde en yüksek bitki rejenerasyonunun kotiledon eksplantının kullanıldığı 3 mg/L BA ve 0.1 mg/L IAA içeren MS besi ortamından elde edildiğini göstermiştir. Agrobacterium aracılı gen aktarım sonuçları en etkin gen aktarım parametlerinin: kotiledon ekplantlarında, ön-kültür süresinin 2 gün, Agrobacterium OD600: 0.6'da 10 dakika, ko-kültüvasyon süresinin 48 saat olduğu uygulamalarda maksimum transformasyon etkinliğinin (%44) olduğu belirlenmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi ile PDS ve SlACO4 genini hedefleyen iki gRNA'nın test edildiği çalışma sonuçları, PDS geni hedeflenen bitkilerde tam albino, kimerik bitkiler ve yeşil fenotipler elde edilmiş ve mutant bitki oranı %71 olarak belirlenmiştir. SlACO4 geninin hedeflenmesi sonucunda elde edilen mutant bitkilerin meyve başına tohum sayıları %85 oranında azalmıştır. Bu çalışma sonucunda ilk kez ticari domates çeşidinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme çalışmaları için Agrobacterium aracılı gen transferi ve doku kültürü parametreleri optimize edilerek, SlACO4 geninin polen oluşumu ile ilişkili olduğu belirlenmiştir.