Optimization of conventional and CRISPR-dcas9-based overexpression systems against root-knot nematodes in tomato

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2024

Tezin Dili: İngilizce

Öğrenci: KARAM MOSTAFA SHAHAT ALI

Danışman: Musa Kavas

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Bitki paraziti nematodlar (PPN'ler) dünya çapında çeşitli bitkiler ve mahsuller için önemli bir ekonomik zorluk teşkil etmektedir. Bitkiler, nematod üremesini engellemede ve M. incognita'nın verdiği zararı en aza indirmede kritik öneme sahip olan, topluca bitki kök eksüdası olarak adlandırılan, suda çözünen ve uçucu organik bileşiklerin (VOC) çeşitli bir kombinasyonunu toprağa salmaktadır. Çalışmamız, köke özgü promotörler (SIRPL11) altında geleneksel aşırı ekspresyon ve CRISPR-ACT3.0 teknolojisini kullanarak Domates bitkisinin köklerinde palmitik asit ve türevlerinin sentezlenmesinden sorumlu çoklu endojen genlerin (FATA, FATB1, FATB2 ve FATB3) ekspresyonunu artırmaya odaklanmaktadır. Geleneksel aşırı ekspresyon yaklaşımında, yabani tipe kıyasla gen ifadesinin ve palmitik asit içeriğinin yukarı regülasyonu gözlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada değerlendirilen hatlar arasında M. incognita'nın üreme indeksindeki (% RI) azalma % 6,5 ila % 71,4 arasında değişmiştir. Geleneksel aşırı ekspresyonun dezavantajı nedeniyle CRISPR-Act3.0 da kullandık. Genlerin aktivasyon etkinliğini sağlamak için, bu durumda her bir genin promotör bölgesini hedeflemek üzere iki tek kılavuz RNA (sgRNA) kullanılmıştır. Bundan sonra, daha kapsamlı bir gen aktivasyon yaklaşımı için çoklu sgRNA kaseti tek bir vektörde birleştirilir. CRISPR-Act3.0 vektörlerinin aktivasyon etkinliğini ve hızlı değerlendirmesini belirlemek için, in vitro Agrobacterium rhizogenes aracılı saçak kök transformasyonu (HRT) Domates'te optimize edilmiştir. A. rhizogenes suşu, birlikte yetiştirme süresi, Domates genotipi ve eksplant tipi dahil olmak üzere farklı parametreler değerlendirilmiştir. Genlerimizin en yüksek transformasyonu, 10 günlük hipokotil ve kotiledon cv. Bobcat'in 3 ve 4 gün boyunca aşılanmış hipokotil ve kotiledonlarında gözlenmiştir. İki hafta sonra, köklerin hipokotilden büyümeye başladığını fark ettik, oysa 4 haftadan daha uzun bir süre sonra kotiledonlardan tüylü kökler gözlemledik. CRISPR-Act3.0 sisteminin genlerimizi aktive etmedeki etkinliği yaklaşık 2,5 ila 18 kat arasındaydı. Bulgularımız, CRISPR-Act3.0 sistemlerinin multipleks gen aktivasyonunu sağlamadaki etkinliğine dair kanıtlar sunmakta ve böylece ekonomik açıdan önemli olan bu türde transkripsiyonel aktivasyonun uygulanabilirliğini artırmaktadır.